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METTL14 R298P突变减少子宫内膜癌细胞系中m6A修饰。 3.  突变体METTL14(R298P)识别m6A修饰的异常基序 鉴于METTL14在靶标识别中发挥作用作者接下来研究了R298P突变是否影响了m6A修饰模式。作者进行了MeRIP-seq分析通过使用抗m6A抗体进行RNA免疫沉淀将m6A修饰位点识别为测序reads高度的增加即峰。这些分析表明大多数靶基因在METTL14/、METTL14/Mu和METTL14Mu/Mu细胞中大部分是共享的(图4A)。此外所有三种基因型的MeRIP-seq峰在终止密码子周围高度富集(图4B)这种分布模式与先前的MeRIP-seq研究相似。然而尽管与已知的m6A修饰位点的典型基序相对应的[U/A/C]GGACU/A序列基序通常富集在METTL14/和METTL14/Mu细胞源性RNA的峰中但在METTL14Mu/Mu细胞源性RNA的峰中检测到一个不同的基序即G[G/A]A[C/U]U (GRAYU)(图4C)。在这个基序中靶向A的3’侧是C和U的混合物目前还没有报道。然而CentriMo分析显示该异常基序位于MeRIP-seq峰的中心区域与METTL14/和METTL14/Mu样品中的典型基序相似这支持了作者分析的稳健性。这些结果表明R298P突变可能改变了METTL14的靶标识别。 作者进一步分析了突变体METTL14识别基序通过使用exomePeak和MetDiff分析重点研究了每种基因型之间甲基化差异的MeRIP-seq峰。exomePeak分析表明与METTL14Mu/Mu细胞相比METTL14/和METTL14/Mu细胞中甲基化程度较高的峰中显著富集了典型的含5’-AC-3’基序。相反与METTL14/细胞相比METTL14Mu/Mu细胞中甲基化程度更高的296个峰中富集了异常的5’ -AU-3’基序。在这296个峰中m6A-Atlas数据库记录了512个典型的m6A修饰位点。在这些位点无论 METTL14的基因型如何用抗m6A 抗体进行 RNA 免疫沉淀获得的测序reads的平均深度都明显高于所有腺苷的平均深度这表明这些典型位点仍可被突变体 METTL14R298P甲基化图4D。相比之下在METTL14/Mu样品中在GGAUU和GAAUU基序的腺苷上的免疫沉淀测序reads的平均深度显著富集而在METTL14/样品中没有观察到这一点。这种富集在METTL14Mu/Mu样品中进一步增强(图4D)。此外MetDiff分析比exomePeak检测到更多的差异甲基化峰该分析显示在METTL14Mu/Mu细胞中甲基化程度较低的峰中再次检测到典型的含有5’ -AC-3’的基序而在METTL14Mu/Mu细胞中甲基化程度较高的峰中富集了异常的5’ -AU-3’基序。综上所述这些数据表明虽然METTL14 (R298P)可以在一定程度上识别典型基序但该突变蛋白也会甲基化异常基序5’-AU-3’中的腺苷。 图4. METTL14 R298P纯合突变诱导的靶标异常识别。 4.  尽管m6A修饰减少但METTL14Mu/Mu细胞中c-Myc mRNA的表达降低 为了鉴定受m6A修饰调控并参与细胞增殖分子通路的基因作者使用基因集富集分析(GSEA)比较了METTL14不同基因型之间的基因表达。该分析显示与METTL14/细胞相比METTL14/Mu细胞中原癌基因c-Myc靶向基因的表达水平显著升高(图5A)。c-Myc抑制剂以剂量依赖性的方式降低了HEC108细胞的活力这表明c-Myc有助于这些细胞的增殖(图5B)。已知c-Myc mRNA的表达受m6A修饰的控制作者在MeRIP-seq分析中观察到多个甲基化峰其中包括典型位点(图5C)。 为了研究HEC108细胞中c-Myc mRNA的稳定性是否受m6A修饰的调控测量了加入放线菌素D (Act.D)抑制转录后c-Myc mRNA的降解率。该分析表明METTL14/Mu和METTL14Mu/Mu细胞中的降解率都显著降低(图5D)这表明METTL14 (R298P)突变导致的m6A修饰的减少而稳定了c-Myc mRNA。然而尽管c-Myc mRNA在METTL14/Mu细胞中表达显著增加但在METTL14Mu/Mu细胞中表达降低(图5E)。相应地GSEA显示与METTL14/细胞相比c-Myc靶向基因在METTL14Mu/Mu细胞中的表达水平显著降低(图5F)。总之这些数据表明m6A修饰减少可以稳定c-Myc mRNA这可能是导致METTL14/Mu细胞增殖增加的原因之一而c-Myc mRNA表达降低的某种机制很可能主导了m6A修饰对METTL14Mu/Mu细胞c-Myc mRNA的影响。 图5. METTL14 R298P 突变使c-Myc mRNA稳定。 5.  异常的m6A修饰会破坏c-MET mRNA的稳定性导致c-Myc的表达减少 为了研究异常识别基序上m6A修饰对基因表达的影响作者比较了METTL14/和METTL14Mu/Mu细胞中含有差异甲基化峰的基因的表达水平。与METTL14Mu/Mu细胞相比METTL14/细胞中甲基化程度较高的峰的基因显著上调(图6A)。然而没有观察到突变体METTL14 (R298P)识别的富含异常基序的峰的基因的类似差异。因此作者进一步将METTL14Mu/Mu细胞中甲基化程度较高的峰的基因(285个基因)分为具有典型m6A位点(174个基因)和不具有典型m6A位点(111个基因)两个亚组并分析相应基因的表达情况发现具有典型m6A位点的基因表达水平显著降低(图6B)。这些数据表明异常的m6A修饰可能会改变典型基序的甲基化效率影响相应mRNA的稳定性。 图6. 突变体METTL14 (R298P)介导的异常m6A修饰降低了存在典型m6A位点的基因表达。 为了确定受m6A异常修饰影响并参与c-Myc上游信号通路的基因作者重点研究了c-MET这是另一种受m6A修饰调节的原癌基因已知在子宫内膜癌中起关键作用。根据GSEA显示在METTL14Mu/Mu细胞中c-MET靶标的表达强烈下调(图7A)因此METTL14Mu/Mu中c-MET mRNA的表达显着降低导致c-MET蛋白表达降低图7B和7C在METTL14/Mu细胞中未观察到这种变化。有趣的是exomePeak分析检测到与 METTL14/细胞相比METTL14Mu/Mu细胞在终止密码子周围的 MeRIP-seq 峰甲基化程度更高其中包括四个异常基序图7D。 为了研究 m6A 修饰在异常基序中的作用作者首先使用c-MET mRNA中含有异常基序 (5’-GGAUU-3’ ) 的 RNA 探针进行电泳迁移率变动测定 (EMSA)。该分析表明与典型基序 (5’-GGACU-3’) 中的 m6A 相比异常基序中的m6A较少被代表性 m6A 阅读器蛋白 YTHDF2 识别。因此异常基序中的m6A修饰会促进阅读器蛋白被招募至相应 mRNA上的说法不太可信。接下来作者检查了每个位点的甲基化效率发现在异常位点上的 m6A 修饰会提高周围典型基序的甲基化效率。为了验证这一观察结果作者采用了基于单碱基伸长和连接的 PCR 扩增法SELECT检测这些位点的 m6A 修饰水平。这项分析表明与METTL14/ 细胞相比METTL14Mu/Mu细胞中c-MET mRNA异常基序中的腺苷被高度甲基化。与此同时在METTL14Mu/Mu细胞中周围典型基序的腺苷也被更多地甲基化。 作者通过添加Act.D抑制转录后测定c-MET mRNA的降解率分析表明METTL14Mu/Mu细胞的c-MET mRNA降解率显著增加(图7E)。此外c-MET抑制剂foretinib的加入降低了METTL14/和METTL14/Mu细胞中的c-Myc表达和细胞活力(图7F和7G)。总之在靠近异常 m6A 修饰位点的典型基序上甲基化效率的提高很可能会促进 c-MET mRNA的不稳定从而导致c-Myc的表达减少并抑制METTL14Mu/Mu细胞的增殖。 图7. 突变METTL14介导的异常m6A修饰使c-MET mRNA不稳定 #   研究结论  # 在这里作者发现与癌症相关的METTL14 R298P突变不仅降低了典型位点的甲基化效果而且还诱导了异常基序上的m6A修饰。这种异常修饰改变了周围典型位点的甲基化模式从而影响mRNA的稳定性和癌细胞的增殖。然而这项研究表明要估计失调的m6A修饰对疾病发病机理的影响十分困难因为这取决于个体m6A修饰的微妙平衡。因此确定受m6A修饰控制的关键基因并确定其对癌症进展的影响对于制定针对m6A修饰的治疗策略至关重要。 图8. METTL14 R298P突变影响m6A修饰的靶标识别从而干扰癌细胞增殖的模型图。 原文链接https://doi.org/10.1016/j.celrep.2023.112688 #  关于我们  # 爱基百客专注于提供领先的表观组学服务可提供方案设计、样本制备、测序、分析以及验证一站式服务。 九月开学季科研新起点爱基百客带着表观产品前来助力部分产品低至8折活动期间表观产品全线优惠欢迎咨询WX:Igenebook0。