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南通网站建设有限公司,淮安网站建设优化,苏州做网页,企业网站营销典型案例哈佛大学单细胞课程|笔记汇总 #xff08;一#xff09; #xff08;二#xff09;Single-cell RNA-seq data - raw data to count matrix 根据所用文库制备方法的不同#xff0c;RNA序列#xff08;也被称为reads或tag#xff09;将从转录本#xff08;(10X Genomic…哈佛大学单细胞课程|笔记汇总 一 二Single-cell RNA-seq data - raw data to count matrix 根据所用文库制备方法的不同RNA序列也被称为reads或tag将从转录本(10X Genomics, CEL-seq2, Drop-seq, inDrops的3端或5端或全长转录本Smart-seq中获得。 Image credit: Papalexi E and Satija R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity, Nature Reviews Immunology 2018 (https://doi.org/10.1038/nri.2017.76) 不同测序方式的优点 3’或5’末端测序 通过使用UMI进行更准确的定量从而将生物学重复与扩增重复PCR区别开来 测序的细胞数量更多可以更好地鉴定细胞类型群 每个细胞成本更低 大于10,000个细胞的结果最佳
全长测序 检测亚型水平isoform-level表达差异 鉴定等位基因特异性差异表达 对较少数量的细胞进行更深的测序 最适用于细胞数少的样品。
我们将主要介绍3’端测序重点是基于液滴的方法 (inDrops, Drop-seq, 10X Genomics)。 3’-end reads (includes all droplet-based methods) 在3’端测序中同一转录本的不同reads片段仅会源自转录本的3’端相同序列的可能性很高同时在建库过程中的PCR步骤可能导致reads的重复因此为了区分是生物学还是技术上的重复我们使用唯一标识符unique molecular identifiersUMI进行标注。 比对到相同的转录本、UMI不同的reads来源于不同的分子为正常生物转录每个read都被计数。 UMI相同的reads来自同一分子为技术重复计为1个read。 上面两条描述是理想情况方便理解实际处理起来要复杂一些。
我们以下图为例下图中分子ACTB的UMI均相同因此只能记为1个molecule而ARL1的UMI不同所以可以记为2个molecule。 Image credit: modified from Macosko EZ et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets, Cell 2015 (https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.05.002)_ 在细胞水平进行正确定量都需要以下条件 Sample index: 样本来源 Added during library preparation - needs to be documented Cellular barcode: 细胞来源 Each library preparation method has a stock of cellular barcodes used during the library preparation Unique molecular identifier (UMI): 转录本来源 The UMI will be used to collapse PCR duplicates Sequencing read1: the Read1 sequence Sequencing read2: the Read2 sequence
例如使用inDrops v3库准备方法时以下内容是reads的所有信息 Image credit: Sarah Boswell(https://scholar.harvard.edu/saboswell), Director of the Single Cell Sequencing Core at HMS_ R1 (61 bp Read 1): sequence of the read (Red top arrow) R2 (8 bp Index Read 1 (i7)): cellular barcode - which cell read originated from (Purple top arrow) R3 (8 bp Index Read 2 (i5)): sample/library index - which sample read originated from (Red bottom arrow) R4 (14 bp Read 2): read 2 and remaining cellular barcode and UMI - which transcript read originated from (Purple bottom arrow)
对于不同的基于液滴的scRNA-seq方法scRNA-seq的分析工作流程相似但是UMI、细胞ID和样品索引的解析会有所不同。例如以下是10X序列reads的示意图其中indexUMI和barcode的位置不同 Image credit: Sarah Boswell(https://scholar.harvard.edu/saboswell), Director of the Single Cell Sequencing Core at HMS_ Single-cell RNA-seq workflow scRNA-seq方法能通过测序的reads解析barcodes和UMI它们在特定步骤里会轻微地不同但除了方法外大致流程都是一致的常规工作流程如下所示 Image credit: Luecken, MD and Theis, FJ. Current best practices in single‐cell RNA‐seq analysis: a tutorial, Mol Syst Biol 2019 (doi: https://doi.org/10.15252/msb.20188746) 中文解读见重磅综述三万字长文读懂单细胞RNA测序分析的最佳实践教程 原理、代码和评述 工作流程的步骤是 生成count矩阵method-specific steps reads格式化对样本进行多路分解demultiplexing即通过barcodes确定reads的来源比对和定量。 原始count的质量控制 过滤质量较差的细胞。 细胞聚类 基于转录活性的相似性对细胞进行聚类细胞类型数簇数 marker识别 识别每个cluster的标记基因。 可选的下游步骤。
无论进行那种分析生物学重复都是必要的 Generation of count matrix 我们聚焦于基于液滴型的3’端测序比如inDrops、10X Genomics和Drop-seq将原始测序数据转换为count矩阵。 测序工具将以BCL或FASTQ格式输出原始测序数据或生成count矩阵。如果reads是BCL格式我们将需要转换为FASTQ格式。有一个有用的命令行工具bcl2fastq可以轻松执行此转换。 NOTE: We do not demultiplex at this step in the workflow. You may have sequenced 6 samples, but the reads for all samples may be present all in the same BCL or FASTQ file. 对于许多scRNA-seq方法从原始测序数据中生成count矩阵都将经历相似的步骤。 umishttps://github.com/vals/umis和zUMIshttps://github.com/vals/umis是命令行工具可用于估计测转录本3端的scRNA-seq数据的表达。此过程中的步骤包括 格式化reads并过滤嘈杂的细胞barcodes Demultiplexing the samples通过barcodes确定reads的来源 比对/伪比对到转录本 折叠UMI和定量reads。
当然如果使用10X Genomics建库方法Cell Ranger pipeline(https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger)将负责执行以上的所有步骤 (10X单细胞测序分析软件:Cell ranger从拆库到定量)。 格式化reads并过滤非细胞barcodes FASTQ文件能解析得到细胞barcodes、UMIs和样本barcodes。对于基于液滴型的方法一些细胞barcodes会对应的低的reads数( 1000 reads) 原因是 encapsulation of free floating RNA from dying cells simple cells (RBCs, etc.) expressing few genes cells that failed for some reason 在比对reads之前需要从序列数据中过滤掉多余的条形码。 为了进行这种过滤提取并保存每个细胞的“细胞条形码”和“分子条形码”。 例如如果使用“umis”工具则信息将以以下格式添加到每条reads的标题行中 (NGS基础 - FASTQ格式解释和质量评估)
HWI-ST808:130:H0B8YADXX:1:1101:2088:2222:CELL_GGTCCA:UMI_CCCT AGGAAGATGGAGGAGAGAAGGCGGTGAAAGAGACCTGTAAAAAGCCACCGNDDBDAFCFCAFHDECII:DGGGHGIGGIIIEHGIIIGIIDHII# 建库中使用的细胞条形码应该是已知的未知的条形码会被丢弃同时对于已知的细胞条形码允许一定的错配。 Demultiplexing the samples 如果测序多于一个样品执行此步骤这是一步不由“umis”工具处理而由“zUMIs”完成的步骤这步会解析reads以确定与每个与细胞相关的样本条形码。 比对/伪比对到转录 通过传统STAR或轻量型Kallisto/RapMap方法将reads比对回基因。 折叠UMI和定量reads 使用Kallisto或featureCounts之类的工具仅对唯一的UMI进行量化得到 Image credit: extracted from Lafzi et al. Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies, Nature Protocols 2018 (https://doi.org/10.1038/s41596-018-0073-y) 矩阵中的每个值代表源自相应基因在各个细胞中的reads数。